生化反應(yīng)中，蛋白質(zhì)定量是最常見的操作之一。二喹啉甲酸（BCA）分析法測定蛋白質(zhì)濃度原理是在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)將銅離子（Cu²⁺）還原成亞銅離子（Cu⁺）。隨后二喹啉甲酸（BCA）與亞銅離子形成藍(lán)紫色的絡(luò)合物，這種絡(luò)合物溶于水并在562nm處存在光吸收峰值，光吸收強度在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)含量呈近似線性關(guān)系，因此使用比色法可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測和定量。

與雙縮脲和Lowry法相比，BCA分析法更敏感，適用范圍更廣；與Bradford法相比，BCA法穩(wěn)定性好?？偟膩碚f，BCA法與其他蛋白測定方法相比具有以下優(yōu)勢：

      ★ 使用方便

      ★ 復(fù)合物顏色穩(wěn)定

      ★ 很少受去垢劑影響

      ★ 測量蛋白質(zhì)濃度范圍廣

本試劑盒測定的蛋白質(zhì)濃度為（100-2000 μg/ml），在此范圍內(nèi)，光吸收值與蛋白濃度呈很好的線性關(guān)系。

       本試劑盒從100到2000μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線參考圖如下。

操作說明

1, 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的配制：

牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品濃度為2 mg/ml。對其進(jìn)行稀釋，制成不同濃度（0，125，250，500，1000，1500，2000μg/ml）的蛋白標(biāo)準(zhǔn)。 

2 , 工作液的配制：

a, 根據(jù)需要測定的蛋白樣品量，配制適合體積的BCA工作液：總的來說，每1倍體積的蛋白質(zhì)樣品需要混合20倍體積的BCA工作液。不同的測試方法需要不同體積的工作液（見下面3和4）。

BCA工作液總量 = （BSA標(biāo)準(zhǔn)品樣本個數(shù)+未知樣本個數(shù)）╳ 復(fù)孔數(shù) ╳ 每個樣本BCA工作液體積

b, BCA工作液的配制方法為：組份A：組份B = 50 : 1 的比例配制BCA工作液。組份B加入組份A的時候，開始會出現(xiàn)渾濁并隨著混勻很快消失，最終混勻后溶液呈淺綠色。該工作液24小時穩(wěn)定。

3，如在試管中進(jìn)行反應(yīng)，取100 μl 的BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)或者待測樣品，放入標(biāo)記好的試管中，再每管加 入2.0 ml工作液，充分混勻，蓋上蓋子，并在37℃ 水浴30分鐘。

4，如需在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)，則每孔放入10 μl的BSA蛋白樣品或者待測樣品，再加入200 μl工作液，充分混勻， 37℃水浴30分鐘。

5，將試管或96孔板冷卻至室溫。

6，用分光光度計或酶標(biāo)儀在562 nm處讀取光吸收值, 所有樣品應(yīng)在2-5分鐘內(nèi)讀完。因為BCA反應(yīng)沒有終點，隨著時間的推移光吸收值會繼續(xù)上升，在5 分鐘內(nèi)讀完所有樣品可以避免產(chǎn)生明顯的誤差。

7，將BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)和待測樣品的光吸收值減去空白對照值，以得到的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品光吸收值對蛋白濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)這個曲線方程計算待測樣品的蛋白濃度。

保存條件

試劑A和B于室溫保存。蛋白標(biāo)準(zhǔn)液-20oC凍存。

注意事項

1)，BCA法與螯合劑（如EDTA、EGTA），還原性物質(zhì)（如巰基乙醇、DTT）兼容性不好。另外，據(jù)報道半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、酪氨酸、肽鍵也能將銅離子還原成亞銅離子。樣品中若含有較多干擾物質(zhì)時，建議采用 Bradford 蛋白濃度測定試劑盒。

2)，每次分析都要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以獲得更準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。

3)，如果得到的蛋白濃度不在檢測范圍內(nèi)，請重新稀釋樣品后再次測定。

4)，BCA分析通常在37℃進(jìn)行。顏色立即發(fā)生變化，并且可以通過高溫孵育加速。高溫（60℃，15分鐘）和/或加長孵育時間（室溫2小時到過夜）可以用來增加靈敏度。在低溫下孵育可以減少顏色生成。

5)，本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

6)，為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。